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    酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)操作步驟

    發(fā)布時(shí)間: 2023-03-30  點(diǎn)擊次數(shù): 1286次

     ELISA檢測(cè)系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中為廣泛為靈敏的技術(shù)手段。下面小編簡(jiǎn)單介紹一下酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)操作步驟。詳細(xì)步驟如下:

    1.用靶蛋白(稀釋于 50 mM 碳酸鹽緩沖液 PH 9.0)包被反應(yīng)板。濃度應(yīng)該做滴度來(lái)獲得。但對(duì)于純化的抗原在1μgml濃度,每孔 50 μl一般情況下足夠。用薄膜覆蓋4oC孵育過(guò)夜。

    2.移去抗原溶液。加入封閉液200μl/孔(PBS containing 1% BSA nd 0.02% azide)以封閉非特異蛋白的結(jié)合。室溫下卵育12小時(shí),或4oC過(guò)夜。

    3.移去封閉液。用PBS漂洗一次。濕潤(rùn)的反應(yīng)板(孔)在密封塑料袋中4oC下可保存4周。使用移去多余液體。

    4.加入用封閉液稀釋的檢測(cè)抗體和對(duì)照 50 μl/每孔??贵w可以做一個(gè)系列稀釋以確定一個(gè)滴度或者用以曾經(jīng)用于篩選試驗(yàn)的濃度,以及根據(jù)抗原含量滴度。室溫下孵育一小時(shí)。

    5.用含0.05%Tween-20Tween-20: sc-29113PBS沖洗培養(yǎng)板3次。吸去多余的液體。

    6.每孔加入50μl用封閉緩沖液稀釋 1:100-1:1000 倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗 ( WB 用常規(guī)二抗)抗體濃度應(yīng)通過(guò)滴度來(lái)獲得。室溫下孵育1小時(shí)。

    7.移去孔內(nèi)液體。用含0.005%Twenn-20PBS沖洗3次并風(fēng)干。

    8.用二乙醇胺緩沖液 (10 mM diethanolamine, 0.5 mM MgCl2 pH 9.5) 沖洗培養(yǎng)孔并移去液體。

    9.用二乙醇胺緩沖液(diethanolamine buffer)稀釋底物(PNPP, sc-3720),終濃度為1mg/ml。每孔加入50μl。反應(yīng)1020分鐘或陽(yáng)性對(duì)照的405490 吸光度約為1.0。加入50μl0.1MEDTAEDTA: sc-29092),PH 7.5。酶標(biāo)儀讀取405490 nm 光吸收值。

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